TNF نشان داده شده است که توسط اندام صعودی ضخیم مدولاری (MTAL) (21) سنتز می شود. در مطالعه حاضر ، ما از تکنیک پچ گیره برای بررسی اثر حاد TNF بر کانال آپیکال 70-PS K + در MTAL استفاده کردیم. افزودن TNF (10 نانومتر) فعالیت قابل توجهی از کانال 70-PS K + و افزایش NP_o[محصولی از احتمال باز کانال (P_o) و شماره کانال (N)] از 0. 20 تا 0. 97. اثر تحریک کننده TNF فقط در تکه های متصل به سلول مشاهده شد اما در تکه های خارج نشده. علاوه بر این ، علاوه بر این از TNF هیچ تاثیری در کانال های K Romk مانند K + K + در TAL نداشت. منحنی پاسخ دوز اثر TNF یک k به همراه داشت_mمقدار 1 نانومتر ، غلظت که فعالیت کانال را به 50 ٪ حداکثر اثر تحریک کننده TNF افزایش می دهد. غلظت مورد نیاز برای رسیدن به فلات اثر TNF بین 5 تا 10 نانومتر بود. اثر تحریک کننده TNF در کانال 7 0-PS K + در حضور N ω-nitro- L-arginine متیل استر مشاهده شد. این نشان داد که اثر TNF توسط یک مسیر وابسته به اکسید نیتریک واسطه نمی شود. همچنین ، مهار PKA بر اثر تحریک کننده TNF تأثیر نمی گذارد. در مقابل ، مهار پروتئین تیروزین کیناز نه تنها فعالیت کانال 70-PS K + را افزایش داد بلکه اثر TNF را نیز از بین برد. علاوه بر این ، مهار پروتئین تیروزین فسفاتاز (PTP) اثر تحریک کننده TNF را در کانال 70-PS K + مسدود کرد. این تصور که اثر TNF ناشی از تحریک فعالیت PTP است با استفاده از روش فعالیت PTP که در آن درمان سلولهای MTAL با TNF به طور قابل توجهی فعالیت PTP را افزایش می دهد ، پشتیبانی می شود. نتیجه می گیریم که TNF کانال 70-PS K + را از طریق تحریک PTP در MTAL تحریک می کند.

اندام صعودی ضخیم (TAL) یک بخش مهم نفرون است که مسئول جذب مجدد 20-25 ٪ از بار NA + فیلتر شده است (11). مطالعات اخیر نشان می دهد که TAL TNF را در پاسخ به LPS باکتریایی ، ANG II و کلسیم خارج سلولی بالا تولید می کند (15 ، 21 ، 28). جوجه کشی TAL با TNF در شرایط آزمایشگاهی مهار کننده RB + حساس به Ouabain (10) ، نشان می دهد که TNF ممکن است حمل و نقل سدیم بین سلولی را در TAL مهار کند. با این حال ، سایت هایی که TNF ممکن است در حمل و نقل غشایی در TAL تأثیر بگذارد ، مشخص نشده است.

کانال های آپیکال K + نقش مهمی در بازیافت K + دارند ، که برای حفظ عملکرد طبیعی انتقال دهنده Na-K-Cl در TAL (11) ضروری است. حداقل سه نوع کانال K + وجود دارد: CA 2 + فعال شده ، هدایت بزرگ و 30 و 70 ps (3 ، 13 ، 29). به طور کلی پذیرفته شده است که کانال های 70- و 30-PS K + کانال های اصلی K + مسئول بازیافت K + هستند (30). علاوه بر این ، این امکان وجود دارد که ROMK یک مؤلفه مهم هر دو کانال 70- و 30-PS K + باشد زیرا هیچ کانال K + را نمی توان در موش های حذفی ROMK یافت (18). ما نشان دادیم که کانال های آپیکال K توسط انواع مسیرهای سیگنالینگ ، از جمله اکسید نیتریک (NO) ، پروتئین کیناز C و پروتئین تیروزین فسپاتاز (PTP) تنظیم می شوند (12 ، 19 ، 32). TNF نشان داده شده است که همین مسیرها را فعال می کند (1 ، 5 ، 16 ، 20 ، 35). بنابراین هدف اصلی مطالعه حاضر بررسی تأثیر حاد TNF در کانال های آپیکال K + در MTAL است و مکانیسمی را که TNF توسط کانال های Apical K + تنظیم می کند ، ترسیم می کند.

مواد و روش ها

تهیه مدولاری تال. موشهای بدون پاتوژن Sprague-Dawley (5-6 هفته ؛ مزارع تاكونیک ، Germantown ، NY) در این آزمایشات استفاده شد. حیوانات روی چو موش طبیعی نگه داشته شده و به مدت 7 روز قبل از استفاده به آب دسترسی رایگان داشتند. موشها با جابجایی گردن رحم کشته شدند و کلیه ها به سرعت برداشته شدند. چندین برش نازک (0. 5-1 میلی متر) از کلیه بریده شد و در رینگر NaCl سرد یخ قرار داده شد. توبولهای مدولاری TAL (MTAL) با دو فورسپس سازنده جدا شدند و روی شیشه ای روکش 5 × 5 میلی متری پوشانده شده با پلیلیسین قرار گرفتند (تحقیقات مشارکتی ، بدفورد ، MA). شیشه پوشش به محفظه نصب شده بر روی میکروسکوپ معکوس (نیکون ، ملویل ، نیویورک) منتقل شد ، و لوله ها با محلول حمام حاوی (در میلی متر) 140 NaCl ، 5 کیلوکلیتر ، 1. 8 میلی گرم سوپر شدند.₂، 1. 8 caCl₂، 5 گلوکز و 10 هپ (pH = 7. 4). ما از یک پیپت تیز برای باز کردن MTAL برای دستیابی به غشاهای آپیکال استفاده کردیم. این لوله با رینگر NaCl فوق العاده شد و درجه حرارت در 37 درجه سانتیگراد حفظ شد.

تکنیک گیره پچ. الکترودها با یک مدل ناریسژ PP83 پیپت عمودی کشیده شدند و در هنگام پر شدن با 140 میلی متر NaCl ، مقاومت 4-6 MΩ داشتند. جریان کانال ضبط شده توسط یک تقویت کننده پچ وصله Axon200a با استفاده از یک فیلتر هشت قطبی (902LPF ، دستگاه های فرکانس ، Haverhill ، MA) در 1 کیلو هرتز فیلتر شد. جریان توسط یک رابط آکسون (Digitada1200) دیجیتالی شد ، که توسط یک رایانه پنتیوم سازگار با IBM (Gateway 2000) با سرعت 4 کیلوهرتز جمع آوری شد و با استفاده از سیستم نرم افزاری PCLAMP 6. 04 (Axon Instrument ، Burlingame ، CA) تجزیه و تحلیل شد. فعالیت کانال به عنوان NP تعریف شد_o، محصولی از احتمال باز کانال (P_o) و شماره کانال (N). NP_oاز نمونه داده ها به مدت 60 ثانیه در حالت پایدار به شرح زیر محاسبه شد

جایی که_منزمان باز کسری است که در هر یک از سطح جریان مشاهده شده صرف شده است. از آنجا که سه نوع کانال K + در MTAL (3 ، 6 ، 13 ، 29) مشخص شده است ، ما جریان کانال را در سه پتانسیل غشای مختلف در هر پچ اندازه گیری کردیم تا هدایت کانال K + را در پچ تخمین بزنیم.

کشت سلولی و اندازه گیری پروتئین تیروزین کیناز و فعالیت PTP. سلولهای MTAL کشت شده برای اندازه گیری فعالیت پروتئین تیروزین کیناز (PTK) و PTP قبل و بعد از درمان با TNF استفاده شد. روش جداسازی و کشت اولیه سلولهای MTAL قبلاً شرح داده شده است (28). سلولهای TAL در حضور یا عدم حضور TNF (10 نانومتر) به مدت 10 و 15 دقیقه انکوبه شدند. ما از روش توصیف شده قبلاً برای اندازه گیری PTK (31) پیروی کردیم. سلولها در 100 میکرولیتر از بافر RIPA لیز شدند [150 میلی متر NaCl ، 50 میلی متر تریس · هیدروکلراید (pH 7. 4) ، 50 میلی متر β-glycerophosphate ، 50 میلی متر NAF ، 1 میلی متر سدیم اورتوآنادات ، 2. 5 میلی متر EDTA ، 5 میلی متر EGTA ، 0. 5 میلی متر دیتیوتئولیتولیتول، 1 ٪ Triton X-100 ، 0. 5 ٪ سدیم deoxycholate ، 0. 1 ٪ SDS ، 100 میکروگرم در میلی لیتر فنیل متیل سولفونیل فلوراید ، 5 میکروگرم بر میلی لیتر آپروتینین ، 5 میکروگرم بر میلی لیتر لوپپتین و 2 میکروگرم بر میلی لیتر فلفل. برای سنجش فعالیت PTK ، 10 میکرولیتر از نمونه در حجم کل 30 میکرولیتر حاوی 200 میکرومتر [32 P] ATP (1 cpm/fmol) ، 12 میلی متر استات منیزیم ، 2 میلی متر mNCl انکوبه شد.₂، 0. 3 میلی متر دیتیوتریتول ، 0. 5 میلی متر سدیم اورتوآنادات ، 0. 5 میلی متر مولیوم آمونیوم-تاریخ و 2 میلی متر پپتید R-R-Src (arg-arg-leu-glu-asp-asp-ala-ala-tyr-ala-ala-gly). واکنش ها با افزودن 200 میلی لیتر از 75 میلی متر اسید فسفریک و 15 میکرولیتر از کوکتل روی کاغذ فسفوسلولوز مشاهده شد. پس از چندین شستشوی ، مقدار 32 P در پپتید R-R-Src با استفاده از یک پیشخوان پوسته پوسته مایع مورد بررسی قرار گرفت.

ما از 32 پروتئین اصلی میلین با برچسب P استفاده کردیم که در اصل توسط Tonks و همکاران شرح داده شده است.(27) به عنوان یک بستر برای اندازه گیری فعالیت PTP. میزان انتشار 32 P از پروتئین اساسی به عنوان شاخص فعالیت PTP استفاده می شود و از مقدار به دست آمده در حضور وانادات به عنوان پس زمینه استفاده می شود. فعالیت PTP با یک کیت سنجش Biolabs PTP به دنبال دستورالعمل ارائه شده توسط Vender (Bio-Rad ، Hercules ، CA) اندازه گیری شد. به طور خلاصه ، سلولهای MTAL کشت شده در حضور یا عدم حضور TNF (10 نانومتر) به مدت 10 دقیقه انکوبه شدند. پس از درمان ، سلولها در محلول بافر 100 میکرولیتر حاوی 50 میلی متر NaCl ، 50 میلی متر تریس · HCl (pH 7. 4) ، 2. 5 میلی متر EDTA ، 2. 0 میلی متر دیتیوتریتول ، 0. 01 ٪ Brij 35 ، 1. 0 میکروگرم بر میلی لیتر آپروتینین ، 1. 0 میکروگرم در میلی لیتر لیزر ، 1. 0 میکروگرم بر میلی لیتر لیز شدند. لوپپتین ، 1. 0 میکروگرم بر میلی لیتر پپستاتین و 2 میلی متر فنیل متیل سیلفونیل فلوراید. این مخلوط (10 میکرولیتر) به یک لوله حاوی بافر سنجش 30 میکرولیتر از 1 میلی متر NaCl ، 50 میلی متر تریس · HCl (pH 7. 4) ، 1 میلی متر EDTA ، 5 میلی متر دیتیوتریتول ، 0. 01 ٪ Brij 35 و 1 میلی گرم در/میلی لیتر BSA در دمای 30 درجه سانتیگراد برای 5 دقیقه اضافی. ده میکرولیتر پروتئین پایه میلین 32 با برچسب P به نمونه اضافه شد و به دنبال آن جوجه کشی به مدت 10 دقیقه در دمای 30 درجه سانتیگراد انجام شد. واکنش با اضافه کردن 200 میکرولیتر از یخبندان 20 ٪ تری کلرید استات به لوله خاتمه یافت. نمونه به مدت 5 دقیقه در 12000 گرم سانتریفیوژ شد ، مایع رویی حاصل با دقت انجام شد و مقدار 32 P آزاد شده از پپتید با استفاده از یک پیشخوان پوسته پوسته اندازه گیری شد.

راه حل و آمار. محلول پیپت از (در میلی متر) 140 کیلوکلیتر ، 1. 8 میلی گرم تشکیل شده است₂CL ، و 5 HEPE (pH = 7. 4). n g-nitro- l-arginine methyl ester ( L-name) و اکسید فنیلارسین از سیگما (سنت لوئیس ، MO) خریداری شد ، در حالی که H8 و هربیمایسین A از Biomol (جلسه Plymouth ، PA) بدست آمد. Herbimycin A در DMSO حل شد و غلظت نهایی DMSO برای تعیین اهمیت آماری بود. اگر مقدار p بود

نتایج

ما برای اولین بار تأثیر TNF را بر فعالیت کانال 70-PS K + در یک پچ متصل به سلول بررسی کردیم. شکل 1 یک ضبط نماینده است که نشان می دهد افزودن 10 نانومتر TNF افزایش NP_oاز 0. 02 ± 0. 02 تا 0. 1 ± 0. 97 (7 نفر). تأثیر TNF بر فعالیت کانال وابسته به غلظت است: افزودن 50 و 500 بعد از ظهر TNF افزایش NP_oاز 0. 02 ± 0. 02 تا 0. 04 ± 0. 33 (6 نفر) و 0. 05 ± 0. 45 (10 نفر). اثر تحریک کننده TNF در غلظت های بین 5 تا 10 نانومتر حداکثر بود (شکل 2). بنابراین ، محاسبه شده k_mمقدار TNF ، غلظت که باعث افزایش فعالیت کانال به 50 ٪ حداکثر مقدار ، 1 نانومتر بود (شکل 2). علاوه بر کانال 70-PS K + ، یک کانال ROMK مانند 30-PS K + نیز در MTAL بیان شد (3 ، 18 ، 29). ما تأثیر 10 نانومتر TNF را در کانال 30-PS K مانند ROMK بررسی کردیم. برای تعیین تأثیر TNF در کانال 30-PS K + ، تکه های حاوی کانال های 30-PS K + با P نسبتاً کم_oانتخاب شدندشکل 3 ضبط شده در یک وصله متصل به سلول است که نشان می دهد TNF بر فعالیت کانال 30-PS K + (3 نفر) تأثیر نمی گذارد زیرا NP_o= 0. 05 ± 0. 51 (TNF) با 0. 05 ± 0. 50 (شاهد) تفاوت نداشت.

شکل 1. ضبط نشان دهنده تأثیر 10 نانومتر TNF در فعالیت کانال 70-PS K +. این آزمایش در یک پچ متصل به سلول انجام شد و پتانسیل نگهدارنده پیپت 0 میلی ولت بود. بالا: دوره زمانی آزمایش و 2 بخش داده های نشان داده شده توسط اعداد گسترش یافته است تا وضوح زمان سریع را نشان دهد. ج- ، کانال بسته شد.

شکل 2. منحنی پاسخ دوز اثرات TNF. تعداد آزمایشی برای هر دوز از 6 تا 10 است.

شکل 3. ضبط اثر TNF (10 نانومتر) در کانال 30-PS K + در اندام صعودی ضخیم مدولاری (MTAL) را نشان می دهد. بالا: 2 اثر فعالیت کانال 1 دقیقه ای است که در غیاب (کنترل) یا حضور TNF ثبت شده است. دو بخش نشان داده شده توسط اعداد برای نشان دادن وضوح زمان سریع گسترش یافته است. این آزمایش در یک پچ به سلول و پتانسیل نگهدارنده 0 میلی ولت انجام شد.

از آنجا که منحنی پاسخ دوز TNF ایجاد شد ، از 5 نانومتر TNF در آزمایشاتی که برای مطالعه مکانیسم استفاده می شود ، استفاده شد که TNF کانال 70-PS K + را تحریک می کند. چندین عامل که نشان داده شده است برای تحریک کانال 70-PS K + شامل پروتئین کیناز A (PKA) ، مسیر وابسته به NO-CGMP و PTP (12 ، 19 ، 29) است. بنابراین ، ما اثر TNF را در کانال 70-PS K + در حضور مهار کننده های PKA بررسی کردیم (شکل 4). مهار PKA به طور قابل توجهی بر فعالیت کانال تأثیر نمی گذارد. علاوه بر این ، مهار PKA اثر TNF را تغییر نمی دهد زیرا استفاده از TNF بیشتر فعالیت کانال را از 0. 03 ± 0. 3 به 0. 1 ± 1. 10 (5 نفر) در حضور H8 افزایش داد. این نشان می دهد که اثر تحریک کننده TNF ناشی از تحریک PKA نیست.

شکل 4. ضبط نشان دهنده اثر 5 نانومولار TNF بر روی کانال K+ 70 pS در حضور H8 (5 میکرومولار). آزمایش در یک پچ متصل به سلول و پتانسیل نگهداری 0 میلی ولت انجام شد. بالا: فعالیت کانال در حضور H8 (کنترل) و TNF + H8 با وضوح زمان کند. دو بخش از داده ها با دوره زمانی طولانی نشان داده شده است.

نشان داده شده است که تحریک گیرنده های TNF تولید NO را افزایش می دهد (5، 16). از آنجایی که مسیر cGMP وابسته به NO می‌تواند فعالیت کانال K + 70 pS را تحریک کند، ما نقش NO را در میانجی‌گری اثر TNF روی کانال K + 70 pS در حضور l-NAME، یک مهارکننده بررسی کردیم. NO سنتاز (NOS). مهار NOS باعث کاهش NP شد_oاز کانال K + 70 pS به 0. 02 ± 0. 13 (n = 5). این مطابق با مشاهدات قبلی است که l-NAME فعالیت کانال 70-pS K + را مهار می کند (19). با این حال، l-NAME اثر TNF را مسدود نکرد زیرا NP را افزایش داد_oاز 0. 02 ± 0. 13 تا 0. 1 ± 0. 9 (n = 5) در حضور 0. 5 میلی مولا ر-NAME (شکل 5).

شکل 5. اثر 5 نانومولار TNF بر روی کانال های 70 pS K + در حضور 0. 2 میلی مولار N G-nitro-l-arginine متیل استر (l-NAME). آزمایش در یک پچ متصل به سلول و پتانسیل نگهداری 0 میلی ولت انجام شد. بالا: فعالیت کانال در حضور l-NAME و TNF + l-NAME با وضوح زمان آهسته. دو بخش از داده ها با دوره زمانی طولانی نشان داده شده است.

چندین مطالعه نشان داد که تحریک گیرنده TNF باعث افزایش PTP می شود (1، 26). ما قبلا مشاهده کردیم که کانال K + 70 pS توسط PTK و PTP تنظیم می شود (12). اگر اثر TNF نتیجه تحریک PTP است که منجر به افزایش دفسفوریلاسیون تیروزین می شود، مهار PTK باید اثر TNF را تقلید کند به طوری که اثر TNF بر فعالیت کانال 70 pS K + در کانال وجود نداشته باشد. حضور یک مهارکننده PTK مانند هربی‌مایسین A. این احتمال با آزمایش‌هایی آزمایش شده است که در آن اثر TNF در توبول تیمار شده با هربی‌مایسین A مورد بررسی قرار گرفت. هربی‌مایسین A. ما یافته‌های قبلی را تأیید کردیم که مهار PTK به طور قابل‌توجهی کانال 70 pS K+ را تحریک می‌کند (12) و NP را افزایش می‌دهد._oاز 0. 02 ± 0. 24 تا 0. 1 ± 1. 22 (n = 5). علاوه بر این، در حضور هربی‌مایسین A، اثر تحریکی TNF بر روی کانال 70 pS K + وجود ندارد زیرا TNF فعالیت کانال را به طور قابل‌توجهی افزایش نداد (NP_o= 0. 1 ± 1. 25). این نشان می دهد که اثرات TNF و Herbimycin A افزودنی نیستند.

شکل 6. تأثیر 5 نانومتر TNF بر روی کانال های 70-PS K + در حضور هربیمایسین A (گیاه ؛ 2 میکرومتر). این آزمایش در یک پچ به سلول و پتانسیل نگهدارنده 0 میلی ولت انجام شد. بالا: فعالیت کانال تحت شرایط کنترل ، در حضور گیاهخوار A و در حضور TNF + Herbimycin A با وضوح زمان آهسته. سه بخش از داده ها با دوره زمانی طولانی نشان داده شده است.

اگرچه مشاهده اینکه اثرات TNF و هربیمایسین A افزودنی نیست ، این مفهوم را پشتیبانی نمی کند که تأثیر TNF بر کانال 70-PS K + با تحریک فعالیت PTP واسطه می شود ، ممکن است TNF نتواند فعالیت کانال را بیشتر کند زیرا آن را می کند. در حال حاضر به دنبال مهار PTK در اوج است. بنابراین ، ما بررسی کردیم که آیا مهار PTP می تواند اثر تحریک کننده TNF را معکوس کند. از آنجا که افزودن اکسید فنیلارسین (PAO) ، مهار کننده PTP ، کاهش فعالیت کانال ، ما تکه ها را با NP بالا انتخاب کردیم_oبرای بررسی تأثیر TNF در حضور PAO. مهار PTP نه تنها NP کاهش یافته است_oاز 0. 04 ± 0. 44 تا 0. 01 ± 0. 21 (5 نفر) اما همچنین اثر TNF را بر فعالیت کانال لغو کرد زیرا NP_oبه طور قابل توجهی تغییر نکرد و 0. 01 ± 0. 18 بود (شکل 7). علاوه بر این ، ما تأثیر PAO را بر فعالیت کانال در MTAL ، که با TNF به چالش کشیده شد ، بررسی کردیم. کاربرد TNF فعالیت کانال را از 0. 02 0. 24 به 0. 1 ± 0. 92 افزایش داد (شکل 8). با این حال ، در حضور TNF ، علاوه بر این از PAO فعالیت کانال را از 0. 1 0. 92 0. 1 به 0. 01 ± 0. 1 (5 نفر) کاهش داد (شکل 8). این بیشتر نشان می دهد که تأثیر TNF در کانال 70-PS K + با تحریک PTP واسطه می شود.

شکل 7. تأثیر 1 میکرومولار اکسید فنیلارسین (PAO) و 5 نانومتر TNF + PAO بر فعالیت کانال های 70-PS K +. داده ها از 5 تکه متصل به سلول خلاصه می شوند.* داده ها با مقدار کنترل تفاوت معنی داری دارند (P< 0.05).

شکل 8. ضبط نشان دهنده تأثیر PAO در حضور TNF. این آزمایش در یک پچ به سلول و پتانسیل نگهدارنده 0 میلی ولت انجام شد. بالا: فعالیت کانال در حضور TNF (5 نانومتر) ، PAO (1 میکرومتر) + TNF و شستشو با وضوح زمان آهسته. سه بخش نماینده نشان داده شده توسط اعداد در مقیاس زمانی سریع گسترش می یابد.

برای بررسی اینکه آیا درمان TNF می تواند فعالیت PTP را تحریک کند ، ما از سلولهای MTAL کشت شده (28) برای اندازه گیری فعالیت PTP در حضور یا عدم حضور 10 نانومتر TNF به مدت 10 دقیقه استفاده کردیم. نتایج خلاصه شده در شکل 9 نشان می دهد که درمان سلولهای MTAL با 10 نانومتر TNF باعث افزایش 32 P از بستر از پروتئین 100 pmol 2،050 pmol/mg (شاهد) به پروتئین 300 pmol/300 pmol/میلی گرم (4 نفر) شد. تأثیر TNF بر PTP خاص بود زیرا TNF فعالیت PTK را تغییر نمی دهد (پروتئین PMOL/میلی گرم 3577 7777 7777 ، TNF 35،250 ± 2،100 PMOL/MG پروتئین ، N = 5) در سلول های MTAL.

شکل 9. تأثیر TNF (10 نانومتر) بر فعالیت پروتئین تیروزین فسفاتاز (PTP) در سلولهای MTAL کشت داده شده. سلولها به مدت 10 دقیقه با وسیله نقلیه (شاهد) یا TNF تحت درمان قرار گرفتند و میزان آزاد شدن 32 P از بستر ، به عنوان شاخص فعالیت PTP ، با پپتید سنتز شده اندازه گیری شد.* داده ها به طور قابل توجهی با مقدار کنترل (بدون TNF) ، P متفاوت هستند< 0.05.

بحث

یافته های اصلی مطالعه حاضر این است که کاربرد حاد TNF کانال آپیکال 70-PS K + را در MTAL تحریک می کند و تأثیر TNF بر فعالیت کانال با مهار PTP و PTK مسدود می شود. مشاهدات مشابه مبنی بر تنظیم TNF به طور حاد فعالیت کانال K + در سلولهای گانگلیون شبکیه (8) و سلولهای میکروگلیا (22) گزارش شده است. در مطالعه حاضر ، ما پیشنهاد می کنیم که اثر استفاده حاد TNF در کانال 70-PS K + احتمالاً با تحریک فعالیت PTP واسطه باشد. این نتیجه گیری توسط چهار خط شواهد پشتیبانی می شود: 1) مهار PTK اثر TNF را بر فعالیت کانال لغو کرد. 2) اثر TNF در حضور مهار کننده PTP وجود نداشت. 3) کاربرد PAO اثر تحریک کننده TNF را معکوس کرد. و 4) درمان سلولهای MTAL با TNF باعث افزایش فعالیت PTP می شود. ما فرض می کنیم که کاربرد حاد TNF فعالیت PTP را تحریک می کند و منجر به تقویت دیفسفوریلاسیون تیروزین می شود ، که باعث افزایش فعالیت کانال آپیکال 70-PS K + در MTAL می شود. با این حال ، هنگامی که PTK توسط Herbimycin A مهار شده است ، اثر TNF وجود ندارد زیرا مهار PTK همچنین منجر به افزایش دیفسفوریلاسیون تیروزین می شود.

نشان داده شده است که PTK و PTP نقش مهمی در تنظیم کانال 70-PS K + ایفا می کنند: تحریک PTK کاهش می یابد ، در حالی که افزایش فعالیت افزایش فعالیت PTP کانال 70-PS K + (12). تأثیر PTK در کانال 70-PS K + احتمالاً نتیجه تحریک فسفوریلاسیون تیروزین کانال 70-PS K + یا پروتئین های نزدیک آن است زیرا افزودن C-SRC اگزوژن می تواند 70-PS K را مهار کند+ کانال در تکه های داخلی (12). ما همچنین مشاهده کردیم که TNF کانال ROMK مانند 30-PS K + را در TAL مهار نمی کند. این نشان می دهد که کانال 30 PS K + به طور مستقیم توسط PTP تنظیم نمی شود. این یافته با یافته های قبلی سازگار است که تحریک فعالیت PTK فقط کانال 70-PS K + را مهار می کند اما کانال 30-PS K + (12) نیست. بنابراین ، مکانیسمی که توسط آن PTP یا PTK تنظیم کانال 30-PS K + آپیکال را با کانال 70-PS K + تنظیم می کند. علاوه بر این ، مشاهده که مهار PTP باعث کاهش کانال 35-PS K مانند ROMK در مجرای جمع آوری قشر (CCD) (34) می شود ، بیشتر نشان می دهد که کانال های K-رده بندی کوچک مانند ROMK در MTAL و CCD نیز هستندبه طور متفاوتی توسط PTK و PTP تعدیل شده است. از آنجا که ROMK1 در CCD است در حالی که ROMK2/3 در TAL (4) است ، این به شدت نشان می دهد که مکانیسم تنظیم PTK ROMK1 یا ROMK2/3 متفاوت است. اهمیت فیزیولوژیکی این یافته که فقط 70-PS اما نه کانال 30-PS K + توسط TNF تنظیم می شود مشخص نیست. گمانه زنی شده است که کانال 30 PS K + ممکن است مسئول ارائه سطح پایه هدایت K + آپیکال باشد ، در حالی که فعالیت کانال 70-PS K + توسط عوامل مختلفی مانند TNF در معرض مدولاسیون قرار می گیرد.

TNF یک سیتوکین است که توسط انواع سلول ها از جمله سلولهای اپیتلیال در MTAL تولید می شود (21). تولید TNF در پاسخ به التهاب ، آسیب و عفونت افزایش می یابد. گزارش شده است که I L-1 و-2 تولید TNF را افزایش می دهد (20). TNF نقش مهمی در التهاب ، تمایز سلول و مرگ سلولی دارد (20). نقش TNF در مکانیسم های پاتوفیزیولوژیکی کلیه به خوبی مشخص شده است. به عنوان مثال ، TNF ممکن است به آسیب توبول مزمن مرتبط با هایپرکلسمی کمک کند. علاوه بر این ، TNF می تواند توسط تحریکات مربوط به فیزیولوژیکی تولید شود. نشان داده شده است که تحریک گیرنده CA 2 + -Sensing باعث افزایش تولید TNF می شود (15 ، 28).

پیش بینی می شود تحریک گیرنده CA 2 + کاهش باعث کاهش جذب Na + در MTAL شود (14). یکی از مکانیسم هایی که با استفاده از آن تحریک گیرنده CA 2 + از حمل و نقل سدیم جلوگیری می کند ، جلوگیری از بازیافت K + در غشای آپیکال در MTAL است. ما قبلاً نشان دادیم که افزایش Ca 2 خارج سلولی با افزایش تولید 20-HETE ، کانال آپیکال 70-PS K + را مهار می کند (33). از آنجا که بازیافت K + مهم است ، مهار کانال های K + باید منجر به کاهش جذب NA در MTAL شود (11). با این حال ، این مکانیسم وابسته به 20-HETE ممکن است مسئول تحریک حاد گیرنده CA 2 + باشد ، در حالی که مسیر وابسته به TNF-Cyclooxygenase (COX) در واسطه تأثیر تحریک پایدار CA 2 +-نقش دارد. گیرنده سنجش در MTAL. نشان داده شده است که تحریک طولانی مدت گیرنده CA 2 + با جوجه کشی سلولهای MTAL در یک رسانه حاوی Ca 2 + بالا برای بیش از 3 ساعت بیان CO X-2 و PGE را افزایش می دهد.₂نسل. TNF نشان داده شده است که پس از تحریک گیرنده CA 2 + -Sensing (28) نقش مهمی در القای CO X-2 دارد. چون PGE₂نشان داده شده است که مهار کانال K + آپیکال (17) و سایر حمل و نقل یون در MTAL (7) ، افزایش PGE₂تولید به دنبال تحریک گیرنده CA 2 + -Sensing باید حمل و نقل NA + را در MTAL کاهش دهد. بنابراین ، متابولیت های وابسته به COX اسید آراشیدونیک احتمالاً در واسطه اثرات تحریک پایدار گیرنده CA 2 + -نقش دارند. اگرچه TNF کانال آپیکال 7 0-PS K + را تحریک می کند ، بعید به نظر می رسد که اثر خالص تحریک طولانی مدت گیرنده CA 2 + باعث افزایش فعالیت کانال شود. این به این دلیل است که افزایش در تولید TNF ناشی از افزایش خارج سلولی Ca 2 + ممکن است به اندازه کافی بالا نباشد تا به طور قابل توجهی کانال 70-PS K + را تحریک کند. محاسبه شد که غلظت TNF در MTAL انکوبه شده در یک رسانه حاوی 2 میلی متر Ca 2 + زیر 10 PM (28) بود. از آنجا که TNF در غلظت های پایین تر از 10 بعد از ظهر بر فعالیت کانال تأثیر نمی گذارد (شکل 2) ، اثر خالص تحریک طولانی مدت گیرنده CA 2 + باید مهار کانال K + Apical باشد.

این یافته که TNF را می توان در mTAL تشکیل داد که در آن 20-25٪ از بار Na + فیلتر شده دوباره جذب می شود، قویاً نشان می دهد که TNF ممکن است بر انتقال غشاء در mTAL تأثیر داشته باشد. این تصور با مشاهداتی پشتیبانی می شود که انکوباسیون mTAL جدا شده در محیط های حاوی TNF به مدت 24 ساعت باعث کاهش جذب Rb + حساس به اوابین شد (10). کاهش های ناشی از TNF در جذب Rb + حساس به اواباین نشان می دهد که TNF انتقال فعال Na + را در mTAL مهار می کند. در مطالعه حاضر، مشاهده کردیم که TNF فعالیت کانال K + 70 pS را افزایش می دهد. از آنجایی که کانال K + 70 pS به طور قابل توجهی به هدایت K + آپیکال و بازیافت K + کمک می کند (30)، انتظار می رود که TNF هجوم Na + را در غشای آپیکال افزایش دهد. این پارادوکس ظاهری را می‌توان با در نظر گرفتن اینکه اثرات TNF وابسته به زمان و دو فازی هستند، توضیح داد: اثر حاد TNF تحریک است، در حالی که اثر مزمن TNF مهار انتقال فعال Na + در mTAL است. همچنین، اثر حاد TNF با تحریک PTP واسطه می شود. این نتیجه مستقیم تحریک سیگنالینگ وابسته به گیرنده TNF بدون دخالت رونویسی ژن است. در مقابل، اثر مزمن TNF بر جذب Rb + نتیجه افزایش بیان و فعالیت COX-2 است زیرا مسدود کردن COX-2 باعث کاهش اثر مهاری TNF بر جذب Rb + می شود (10، 28). بنابراین، اثر TNF بر انتقال در mTAL نه تنها به غلظت بلکه به عوامل زمانی نیز بستگی دارد. پدیده مشابهی که پاسخ سیگنال‌دهی سلولی به هورمون‌ها به زمان یا الگوی قرار گرفتن در معرض آن بستگی دارد، در واسطه‌ای اثر فاکتور رشد گزارش شده است (2).

نقش TNF در تنظیم حمل و نقل اپیتلیال در MTAL مشخص نیست. از آنجا که تولید TNF توسط محصولات باکتریایی و سیتوکین ها تحریک می شود ، ممکن است TNF مسئول کنترل غیر طبیعی کلیوی NA + در شرایط پاتولوژیک باشد. در این راستا ، گزارش شده است که دفع سدیم کاهش می یابد ، در حالی که تولید TNF در موش های دیابتی افزایش یافته است (9). علاوه بر این ، TNF جذب Na + در سلولهای توبول دیستال جدا شده از موشهای صحرایی دیابتی را تحریک می کند (9). بنابراین ، قابل تصور است که TNF ممکن است با تحریک بازیافت K + ، حمل و نقل سدیم را تحت شرایط خاصی در MTAL افزایش دهد. علاوه بر این ، گزارش شده است که آپوپتوز سلول ناشی از TNF مربوط به فعال سازی کانال های K + است که منجر به از بین رفتن K + داخل سلولی می شود (23 ، 24). در واقع ، مهار کانال های K + برای جلوگیری از مرگ سلولی در لوله‌ی پروگزیمال ناشی از هیپوکسی (25) نشان داده شده است. با این حال ، مطالعه بیشتر مورد بررسی قرار می گیرد تا بررسی کند که آیا فعال شدن کانال های آپیکال K + رویداد اولیه آسیب سلولی ناشی از TNF در MTAL است.

در نتیجه ، استفاده حاد TNF کانال آپیکال 70-PS K + را تحریک می کند و اثر TNF به احتمال زیاد با افزایش فعالیت PTP در MTAL واسطه می شود.

افشای

این کار توسط مؤسسات ملی کمک های مالی DK-54983 (W. H. Wang) ، HL-34300 (W. H. Wang) و HL-56432 (N. R. Ferreri) پشتیبانی می شود.

پانویسها و منابع

هزینه های انتشار این مقاله تا حدودی با پرداخت هزینه های صفحه کاهش یافته است. بنابراین مقاله باید مطابق با 18 ایالات متحده آمریکا "تبلیغات" مشخص شود. بخش 1734 صرفاً برای نشان دادن این واقعیت.